实验室使用CRISPRi多重调控枯草芽孢杆菌代谢通路生产乳糖-N-新四糖

在最近发表的文章《CRISPRi-guided multiplexed fine-tuning of metabolic flux for enhanced Lacto-N-neotetraose production in Bacillus subtilis》中，有研究人员探究改造枯草芽孢杆菌生产LNnT。首先研究人员改进了CRISPRi系统，Cas9蛋白用木糖诱导启动子表达并整合到枯草芽孢杆菌基因组。针对LNnT生物合成中的三条竞争途径共4个基因，每个设计了8个sgRNA，通过单独抑制每条通路，筛选可以提高LNnT/葡萄糖转化率的最佳靶向sgRNA。随后，对三条竞争途径，包括糖酵解途径中的pfkA和pyk基因、戊糖磷酸途径中的zwf基因和在磷壁酸合成途径中的mnaA基因表达进行下调，LNnT效价由1.32 g/L提高到1.55 g/L。此外，为了提高乳糖-N-三糖II（LNTII）向LNnT的转化效率，在分支途径中敲除tuaD基因，并过表达了lgtB基因，使LNnT滴度进一步提高到2.01g/L。最后，优化了诱导剂木糖的添加时间和用量，在摇瓶中LNnT效价达到2.30g/L，在3l生物反应器中LNnT效价达到5.41g/L。为生物法规模化制备LNnT奠定了基础。相关研究发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry杂志上，通讯作者为刘龙教授和王淼教授。