利用nCas9-易错DNA聚合酶组合实现酿酒酵母基因多样化

更新时间：2020-08-05 点击次数：9

当前为了获得菌株基因多样化，通常采用体内体外相结合的方式进行，然而这些方法依赖于体外多样化和体内选择的不可扩展和转化受限的循环。因此无法快速高效的获得自定义位点的基因多样化结果。最近，在大肠杆菌中开发了一类新的体内突变系统——evolvR，该系统通过gRNA引导nCas9到目标序列，进一步通过与nCas9连接的高易错的DNA聚合酶完成定点基因的突变。相对于野生型突变率提高了七个数量级。然而在真核生物中还没有一个具有特异性与基因组正交的体内突变系统。

近日，发表在《ACS Synthetic Biology》的“Targeted diversification in the S. cerevisiae genome with CRISPR-guided DNA polymerase I”一文中（通讯作者为加州大学伯克利分校John E. Dueber教授），作者在原有evolvR基础上成功在酿酒酵母中开发了yevolvR系统。作者首先将无义突变的URA3基因整合至酿酒酵母基因组上，并在筛选培养基进行培养，通过野生型和利用yevolvR系统方式对比发现，利用yevolvR系统突变率提高了四个数量级，能够快速地获得突变菌株。进一步作者开发了双gRNA靶向系统，再靶向无义突变的URA3基因同时，还靶向了CAN1（一种精氨酸渗透酶基因），在无尿嘧啶及含有毒的精氨酸类似物培养基上进行筛选，结果发现同时靶向可提高约3个数量级。通过该系统可高效快速的在酿酒酵母中自定义的完成基因多样化。

（编辑：恒鲁生物）

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